Ornamentum FastKing rt (In gDNase)

A I-RNA degradetur

Qualis est princeps neque inquinatus admixtus --Purify ARN. Unde si materia quam recentissimum quin extrahatur rna RNA degradationem. Spermatophyta Dicotyledones integritas in conspectu denatured aestivum RT reactionem. Post RNA, ita ut potestate condatur serveturque in C% formamide. RNase precursor si adhibetur, debet esse in calore temperatus <XLV ° C, pH atque cum sit minus quam 8.0, aliter in omnibus vinctum RNase precursor et dimittere. Sed et si RNase precursor non addidit, in quibus solutions ≥ Metro 0.8 mm.

A II-RNA transcriptionis contineat adversa reactiones de inhibitors

--Reverse inhibitors includit SDS transcriptio, EDTA glycerolum, sodium pyrophosphate, spermidine, formamide, guanidine sal, etc. Gloria in potestate rna sunt in sample: cede, conferantur cum potestate RNA reactionem ad reprehendo utrum sit an inhibitor. Aequaliter lava rna sunt LXX% (V / v) ethanol praeservatum ad removendum inhibitors.

A III-annealing Consentaneae desunt autem propter primers summatim referendo ad primum filum de slug cDNA,

Quod temperatus non --Determine annealing primers idoneam ad usus est in experimentum. Nam temere hexamers proponendas, suadetur ut a temperatus XXV ° C ad X min reactionem ad finem temporis temperatus. Utilia enim primers gene (GSP), GSP alia experiri, vel switch ad oligo (di) non temere hexamer.

A IV-RNA Parvus moles incipiens

--Increase moles RNA. Nam RNA exemplaria minus quam L g 0.1 μg, ad 0.5 μg, acyl BSA potest esse primum litus progressus cDNA

De V-A scopum non expressit in resolvitur ordine textuum.

--Try aliorum textuum.

A VI-reactionem ratio PCR

RT-PCR --For duos gradus, et gradus qui praeterire non poterunt PCR discoideum cDNA template de 1/5 in volumine reactionem.

Non I-A-specifica annealing deterget et in Templates

3'Motorium, neque finem habet primers 2-3 g sive DC. Utilia primers Gene usus in primo prope litus vel compositionis loco temere primers oligo (dT). Uti supra priores cursus annealing calidissimum et inferiorem annealing tortor. Uti calidum satus Taq-DNA ad reactionem ad proprietate PCR ut amplio.

A consilio a gene-II Pauper Utilia primers

--Follow eisdem principiis de primario consilio amplificationis causa interponitur.

A III-RNA contaminata est in DNA

PCR-RNA --Treat per gradus ascendit DNase I. Posuit et non vicissim reactionem imperium in transcribenda deprehendere DNA contagione.

Firmati inter A-IV de primario dimer

--Design primers sine complementary in III series est.

A altus-V mg Nimis²⁺ coniunctis

--Optimize M,²⁺ compositum enim retrahitur primario hold

A VI-crocei commixtione corruptum aliena DNA

Aerosol --use repugnans tips et UDG ipsum.

I-A contentus est primum productum est prope litus Excelsa

--Reduce moles productum harena primum reactionem est in conventional PCR gradus.

A summo primario Nimis-II, in quantum reactionem PCR

--Reduce initus primario.

Nimis multi-III A cycles

PCR --Optimize reactionem conditionibus et PCR minuere numerum exolvuntur.

A IV Nimis humilis-temperatus annealing

--Increase annealing temperatus ne voluptate et luxuria non-specifica extensio.

Non V-A-specifica generatae per amplificationem, fragmentorum oligonucleotide DNase RNA degradationem DNA --Extract summus qualis DNA ne contagione.

Transcribe slug cDNA, mRNA in RT-PCR est ut novis epistolis, uti et vicissim reactionem PCR transcribed slug cDNA, ut Exemplum autem subintravit ut in scopum partem relicturus. Ritum Primers passim, imprimis Primers gene Oligo dt, secundum specificam rationem experiri. Primers super omnes enim potest esse quin brevi eukaryotic hairpin structuram cell sequence.

Random primario: congruentibus enim quamdiu rna sunt compages hairpin, tum omnes tales ut RNA rRNA sequence, tRNA, et cetera ad usus maxime qui de uno RT-PCR reactionem Amen.

Di Oligo: congruentibus enim rna sunt polyA tendentem fuerant (prokaryotic RNA, eukaryotic Oligo di rRNA tRNA non polyA ut huc illucque discurrerent). Oligo enim dT remanebit tenetur polyA est cauda, ​​et RNA exempla qualis requiritur quod sit princeps, atque adeo magna et parva degradation redigendum moles moles plena longitudo cDNA.

Gene-specifica primario: Formula completivae in tempore suo idoneam ad scopum oculis habita Consequentia nota.

Sunt duo vias:

1. Internus referat modum, in doctrina, slug cDNA, mRNA sit disparibus superaverunt fragmenta, ne propter aestivum qui linunt est. Si copia rna humilem ostendam nullum aestivum sed non augeri per productum PCR nulla. In generali, potest internus referat ad discoideum cDNA deprehendere. Si enim eventus est internum referat, quod fieri potest basically slug cDNA, qualis est fides (paucis casibus, si scopum gene fragmentum nimis longum est, ibi ut sit quibusdam exceptis).

2. si enim esse est scitum a gene ampliari haec Template, potest non verificatur hoc gene in primers. Tum amplificata, necessario medium quod internum non referat apud slug cDNA, non est dubium. Quia secundum interiorem alte copiam cDNA facile augere. Si discoideum cDNA tuos abeat frater sui parte, propter varias causas veri simile est ab perspective: results a PCR genes et humilis scopum abundantia unt vehementer commovetur. Usque dum internum sit altum, in abundantia referat, ad exaggerationem consequitur verisimile non esse affectus.

Partialiter RNA culturae gradu. Integritas est deprehendere, et mundaret RNA

Diversas species diversa argumenta RNA sed generaliter contineat duas clare exprimatur RNA 28S 18S et vincula gel et splendor ille bis acie usque insequentis fuerit. Quod datis 5S cohortis indicat RNA tuos abeat frater tuus est: et de gradu suo claritas proportionalem esse sublatum est. Secundum interiorem feliciter amplificationem non Difficultas rna nihil enim interno agitur magnum nimis RNA degradationem non possit augeri, quamdiu terra. et OD₂₆₀/ EUS₂₈₀proportionem inter 1.9 et 2.1 purus sit spectrophotometer rna mensuratur. A moles parva dapibus inquinamentum ad redigendum Ratio autem ARN. Quamdiu enim pretii est etiam humilis, RT non affectus. Rt Quid est enim summa probitate rna.

Extensio internum non tantum gene referat indicant pro rt habet, sed qualis est non necessario ad ad ad discoideum cDNA tangentia litus. Interiores enim refert plerumque magnitudine fragmenta atque dicendi sunt magis prospere transcriptum diverso. Tamen magnitudinem et gene expressio ad scopum a gene gene variant. Slug cDNA, qualis est, non potest iudicari nisi per internum in scopum superaverunt fragmenta diutius quam maxime referat II kb.

Quaedam enim exemplaria universa opera secundarium, aut G. C contentus est dives, seu ex quo honorabilis factus es humilem abundantia. His rebus minime conveniens esse, pro magnitudine transcriptase scopum fragmentum quod gustatum. GC per altos contenta rna templates multiplicique structuram secundam difficile aperire structura frigiditas secundarius seu communibus transcriptase converso. Ea enim, Quant inversa lectus Transcriptase potest, cum eius contrarium sit manifesto perficientur meliorem transcriptionem quam M-series e converso transcriptase MLV quo avertet Transcribe variis RNA efficiently Templates and transcribe slug cDNA, mRNA in litus progressus primo quantum ad maximum. Cum usura communis transcriptase ornamentum vicissim: ratio potest tantum valet e converso Transcribe μl XX I μg, et RNA. Placere operam dant facultatem ad RT maximum ornamentum est. Si addidit pede vel est in excessu, et e converso transcribenda favent RNA in magna abundantia. Ideo melius est plures quam maximam facultatem et ratio.

I-RNA, decernite si A est graviter abeat, si rt et felix sit

Generaliter refertur amplificationis causa cessante interna causa gravis saepius RNA degradationem. Alius potest esse e converso quod transcriptio defectum. Internum usum referat ut a vexillum ut non possunt iudicare de slug cDNA, qualis est una litus progressus, nisi iudex, ad vexillum ut possit esse e converso transcriptionis sive sit felix Si illic 'dubium est qualis ARN. Maxime in transcribenda processus vicissim reactionem ratio est ponere a constant temperatus et assidue ut reactionem ad meliorem efficientiam.

A II-restat an dentur enim primers reliable amplificandam internum referat genes, et si illic 'sint reagentia, sunt difficultates in aliquo PCR.

Nam aliquando tenetur relative, quanta ante RNA est e converso transcribenda, requiritur etiam, quae multa in transcribenda rhoncus quam e converso, exempli gratia, cum quantitare initus I μg, mRNA. Cum autem vicissim transcribed est mixta solution slug cDNA, mRNA comprehendo, oligo di, enzyme dNTP, et DNA parum residui, ut hue circuitus causa, ita non potest ad quantitare discoideum cDNA verius. Unde necesse est quantitas ARN. Contra Adversus transcribenda efficientiam idem inter alia exempla, eadem moles discoideum cDNA adeptus sit, et quantitatis analysis can monstrant in comparationis gradibus expressio alia genes in idem amount of total RNA. Cum fluorescens quantitatis ad aliquid faciendo PCR, discoideum cDNA quantitatis, non requiri, ut post transcriptionem vicissim gene referat internum quod pati possit, ut referat.

Hoc est maxime ad genes, et e converso transcriptio non posse diu de fragmentis omnium genes. Primo longe inferior quam transcriptum efficatiam PCR converso. Secundo per GC planum dives regionem, et multos ex Genes secundarium structuram restringere utrumque transcriptum & PCR e converso. Deinde amplificandi fidelitatis praestare difficile PCR simul efficere. In contrarium est processus in transcribenda, nemo potest praestare ut longo fragmentum ad genes in exemplum humilis, praesertim per oligo di. V, sicut per 'pluribus G. UTR et est etiam magis difficile. Ergo est etiam rationabile est ut novis epistolis modum transcript primers cum temere, naturalis FISSIO sites invenire scopum ad fracturam, amplificare et per partes, et praestare et digestionem ita restringenda ligation. Et generalis est difficile ad directe Amplify superaverunt fragmenta II MB maior, quam, ut verum est, semper posse consequi atque obtinere 1.First omnium, praestare integritas Angiospermae / cDNA, et TRIZOL extraction esse malebat. 2.M MLV-rt-ornamentum PCR possunt directe solebat. ANNEALING extend et numerum auget exolvuntur ad extollendam apte processus. Vel PCR habitant possunt aut duos motus primus recte gerere prorogato denaturation vel amet ante latiusque PCR augendi fragmenta quae utilia extenditur. Attendite polymerase fidem. 3.Long Taq potest consequi optimum results in PCR. 4.For dapibus expressio application, princeps polymerase fides adhibenda est.

Sunt duo genera vicissim transcriptase obtulerunt in TIANGEN: QuantAntiquaCTT / regem et RTase TIANScript MLV-M. In hoc potissimum differt initus est eorum moles templates. Est a unique e converso transcriptase quantitate quae sit alia ab communiter MLV-M virus ex Moloney murine leukemia. Quant summus eu nova per ipsum contra transcriptase recombinantly Mus. II L g-aptum quant amplificandae μg princeps cedat actione Transcriptional RNA altis contra. Cum Ordinarius aut MMLV AMV, de quantitate est valde maximus ut nota est igitur regnum in RNA fortis Templates and Templates non avertet transcript universa caliditas denaturation. G. C contentus Template Cum enim superiore e conuerso est altior efficientiam. Sed ea clades transcriptase RNase ii actio est quae afficit, ut in longitudinem product (idoneam de <4.5 MB templates). Contrarium enim placitum transcribenda, vicissim TIANScript MMLV transcriptase commendatur. Haec est mutatio RTase enzyme actio est admodum RNase H, ut sit idonea ad longum (> V kb) cDNA.

Unum-gradus vicissim, tum amplificata sunt transcribenda & PCR: apud eundem, perficitur absque tubi foramen fistulae operculum inter cDNA exaggerandam et amplificandam, quod utile est ad redigendum contagione. Quia omnis adeptus discoideum cDNA exempla sunt amplificationis dabitur, altior est sensus, cum minimum 0.01 pg of total RNA. Quoniam felix est, RTPCR gradus, quae vulgo ad gene-specifica promovendam primers cDNA. Duo gradus, modum, nimirum contrarium ferri ex in duo gradus est, augendi & PCR: transcribenda. Primum e converso transcriptio fit rna template cDNA habere et haberi vel diversa subiecta cDNA PCR profectae. Duo gradus, modum oligo potest (di) non temere primers ad dirige in primo filum de summam complectitur de slug cDNA, mRNA sequence, et avertet omnia Transcribe propria notitia ex specimen.