Ieiunium-Site Mutagénesis dirigida Ornamentum

Formula I-A

■ Exemplum continet impudicitiis, vel dapibus Taq inhibitors, etc. --Purify DNA down, tollere impudicitiis dapibus vel rhoncus quam extract template DNA cum purificatione.

* The denaturation varius vitae, est non completum et per patientiam sustentatur denaturation temperatus denaturation --Appropriately incremento est.

Formula degradation --Re ■ parare, Formula.

A II-primario

■ miseram qualis est primers --Re synthesize, primario.

■ primario princeps deformitatem --Aliquot enim primers in parva volumine retrahitur ad conservationem intendat. Ne multa et longa-term congelatio tabidaque cryopreserved IV ° F.

■ Inproper primers Consilium (eg de primario longitudinem non sufficient: dimer Inter primers, etc.) -Redesign primers (devita formation de primario dimer et secundarium structure)

A III-M,²⁺coniunctis

■ M,²⁺ hoc preme concentration --Properly incremento M,²⁺ concentration: optimize in M,²⁺ concentration per seriem aperiunt mM a I ad III 0.5 mm determinare optimal mM per aliquod temporis spacium M,²⁺ concentration hold pro primario.

A IV-temperatus Annealing

* The annealing altum temperatus afficit de primario binding and Amen. Et ad optimize ad condicionem cum --Reduce annealing temperatus II ° ex gradiente.

Tractus A tempore V-

Short extensio temporis ■ - crescite extensio est.

Cognoscere causas: Negativa exemplaria sequentia vincula et ostendam in scopum.

A-I Aspergillus niger ex PCR

■ Cross ubi contaminantes magis scopum ad amplificationem products ordo, vel in sample Pipet --Carefully non continet scopum et effundet eos extra ordinem in negans sample centrifuge invenit. Aut apparatu sunt reagentia oportet ut nucleic acida autoclaved existentium salutem nobis tribue benignus et inquinatus admixtus esse debet determinari potest per imperium experimenta negans.

■ Reagent --Aliquot inquinatus admixtus est reagentia, et copia ad low temperatus.

A-II Primusr

■ M,²⁺ hoc preme concentration --Properly incremento M,²⁺ concentration: optimize in M,²⁺ concentration per seriem aperiunt mM a I ad III 0.5 mm determinare optimal mM per aliquod temporis spacium M,²⁺ concentration hold pro primario.

Vitio ^ ■ primario consilio et conexio habet scopum est non-scopum homology in serie. --Re consilio, primers.

Cognoscere causas: et PCR extollendam vincula sunt contra rationem magnitudinis expectata, aut magnum aut parvum, aut amplificandi aliquando tum specifica, et vincula vincula non-specifica ad amplificationem fieri.

I-A primario

■ Pauper proprietatem primario

--Re consilio, primario.

* The concentration primario et per patientiam sustentatur temperatus est nimis alta --Properly proventus denaturation denaturation est.

A II-M,²⁺ coniunctis

■ A M,²⁺ Mg2 + retrahitur est nimis alta ad redigendum --Properly concentration: optimize in M,²⁺ concentration per seriem aperiunt mM a I ad III 0.5 mm determinare optimal mM per aliquod temporis spacium M,²⁺ concentration hold pro primario.

A III-Oxidoreductases polymerase

--Reduce enzyme enzyme nimia moles moles interdum appropriately ■ ii 0,5

A IV-temperatus Annealing

* The annealing temperatus est etiam humilis temperatus --Appropriately proventus annealing non capere duo-scaena modum annealing

A-V cycles PCR

Nimis multi ■ PCR cycles --Reduce numerum PCR conuersione recurrentium.

I-A primarioPrimario, designat proprietatem --Poor --Re mutant situs longitudine sua proprietate augendae primario; munusve faceret fecerunt nidos PCR.

A II-Formula DNA

Motorium non est pura --Purify varius vitae Formula an extract DNA expiationis rhoncus et.

A III-M,²⁺ coniunctis

--Mg²⁺ retrahitur est nimis alta --Properly redigendum M,²⁺ concentration: optimize in M,²⁺ concentration per seriem aperiunt mM a I ad III 0.5 mm determinare optimal mM per aliquod temporis spacium M,²⁺ concentration hold pro primario.

A IV-dNTP

--The retrahitur dNTPs --Reduce sunt nimis alta retrahitur dNTP appropriately

Annealing temperatus V-A

--Too annealing humilis temperatus caliditas --Appropriately proventus annealing

A VI-orbem

--Too --Optimize multas itidem per numerum exolvuntur

Et primus gradus est eligere oportet polymerase. Non propter indigentiam 3'perscrutavi polymerase iusto Taq-V 'exonuclease actio et mismatch erit extensio valde reducere efficientiam fragmentorum plenos. Ideo non valet Amplify scopum superaverunt fragmenta regularis Taq polymerase maior quam V kb. Summa fide vel specialibus polymerase Taq modus extensionis polymerase legeretur condimentum amplificationem fragmentum efficien- dum necessitatibus occurrere. Praeter fragmenta requirit debitam commensurationem amplificationem multum primario consilio denaturation temporis extensione temporis quiddam pH etc Vestibulum Primers 18-24 BP cum ad melius cedunt. Ut ne template damnum, in tempore denaturation XCIV ad XXX ° ad id prolapsae in cycle per sec minusve et surgendi tempus advenerit coram ° F XCIV temperatus ad extollendam sit minus quam I min. Praeterea, temperatus fere LXVIII ° F profecta est extensio extensio intendebant et in tempore secundum ad rate of I kb / min potest curare efficax tum amplificata, dum fragmentorum plenos.

PCR error rate in extensionem posse vinci magna usura variis DNA polymerases constantem fidem nuntiabant. Inter omnes Taq inventa usque DNA polymerases, Pfu enzyme error rate habet infimum et summum fidelitatem (videre mensam coniuncta). In praeter lectio enzyme, adhuc potest minuere PCR inquisitores per mutationem optimizing reactionem rate conditionibus, inter optimizing quiddam compositionem, retrahitur thermostable polymerase et optimizing PCR numerus exolvuntur.